Approfondimenti

I modulatori fisiologici biodinamici, oggetto della presente relazione, (Citozym, Ergozym, Propulzym, Probiotic P-450), sono preparati con prodotti agricoli assolutamente non transgenici, coltivati su terreni a perfetta sanità biochimica. La rigorosità con cui si preparano le materie prime agricole nasce dal fatto che non sono minimamente ammissibili i prodotti transgenici in quanto gli stessi vengono discriminati dagli enzimi cellulari e non accettati dal metabolismo animale e umano. Riveste notevole importanza, nella coltivazione, l’assenza di diserbanti, pesticidi, fitofarmaci e altri prodotti di sintesi in quanto questi prodotti rilasciano veleni di difficile eliminazione e in netto contrasto con le proteine che si devono produrre.
Per quanto sopra specificato i prodotti biodinamici (denominati modulatori fisiologici) sono derivati da una coordinata attività di processi biochimici su materie prime vegetali rigorosamente biologiche, ottenendo una serie di biomolecole perfettamente coniugate secondo i principi della biochimica umana. Sono pertanto una felice combinazione di pacchetti energetici (ATP-NAD-FAD) in grado di interagire nei processi duplicativi delle cellule, possiedono una gamma di proteine in grado di modulare, partecipando in forma diretta, la sintesi delle proteine promosse sia nella replicazione del DNA che nelle eventuali fasi di correzione degli errori di trascrizione.

Essendo la produzione di questi prodotti effettuata secondo i canoni della biochimica relativa ai vari cicli vitali (ciclo di Krebs, degli acidi grassi, dell’urea, ecc.) si arriva alla costruzione dei “codoni” di amminoacidi e di tutti i componenti energetici necessari ad implementare tali cicli.
Accanto alle proteine di base, amminoacidi e coenzimi, questi prodotti contengono anche le attività di controllo genomico del DNA cellulare, perciò sono in grado di riconoscere anomalie cellulari, siano esse derivate dalla mutazione genetica portata da una errata trascrizione o da una modifica fisiologica operata da virus e retrovirus. La loro azione si esplica pertanto a livello genetico e pur essendo specifica non è distruttiva in quanto le proteine corrette non vengono eliminate ma ricomposte secondo lo schema della fisiologia cellulare sana.

Meccanismi di trasduzione dei segnali.

Si fa riferimento alle mutazioni del gene ras, un proto-oncogene localizzato sul versante interno della membrana plasmatica del cromosoma 12p13; come la maggior parte degli oncogeni che codificano per proteine importanti nel controllo della crescita cellulare, il ras codifica per una proteina associata alle membrane con attività intrinseca del tipo guanosina trifosfato (GTPasi). La mutazione di ras è riscontrata a livelo del codone 12 e coinvolge frequentemente la transizione di una seconda base di guanina ad adenosina (GGT
GAT) che altera la capacità intrinseca della GTPasi ad idrolizzare il GTP a GDP. Le proteine ras sono essenziali per la trasduzione dei segnali promuoventi la crescita dei recettori tirosin chinasi delle superficie cellulare alle vie metaboliche intracellulari coinvolte nella differenziazione e nelle proliferazione: pertanto, l’attivazione della ras determina una crescita cellulare incontrollata.

Citozym, in associacione a Ergozym, interviene sulla mutazione ras eliminando la transizione di seconda fase (GGT -> GAT) e ripristinando, di conseguenza, la capacità della GTPasi ad idrolizzare il GTP a GDP.
L’oncogene ras rappresenta il miglior esempio di attivazione da mutazione puntiforme; le mutazioni identificate riducono tutte drammaticamente l’attività GTPasica delle proteine ras e la maggior parte di esse coinvolge il codone 12.
Un elevato numero di tumori umani porta mutazioni del ras; ad esempio, il 90% degli adenocarcinomi pancreatici e dei colangiocarcinomi è caratterizzata dalla presenza di mutazioni puntiformi di ras, come pure il 50% dei carcinomi del colon, dell’endometrio e della tiroide, il 30% degli adenocarcinomi del polmone e delle leucemie mieloidi. Sebbene le mutazioni ras siano molto comuni, la loro presenza non è essenziale per il processo di cancerogenesi; la cancerogenesi può avvenire atraverso diverse vie e, tra esse, quelle della mutazione del ras.

Molecole che regolano la trascrizione nucleare ed il ciclo cellulare.

I geni oncosoppressori qui trattati (Rb, , p53, p16 e WT-1) sono localizzati all’interno del nucleo; questi geni in associazione al ras contribuiscono tutti assieme con vari segnali di controllo del ciclo cellulare, cioè fanno parte del sistema di controllo per il passaggio delle cellule attraverso le fasi del ciclo cellulare.
Il gene Rb; Quando le cellule quiescenti vengono stimolate da fattori di crescita, la concentrazione di cicline D ed E si innalza e la conseguente attivazione dei complessi ciclina D/CDK4, D/CDK6 e E/CDK2 portano alla fosforilazione di pRb; la forma ipoerfosforilata di pRb rilascia i fattori di trascrizione E2F, i quali formano degli eterodimeri con la famiglia di proteine DP ed attivano la trascrizione di diversi geni bersaglio. I dati più recenti sulla biochimica di queste attività suggeriscono che il complesso pRb-E2F si leghi attivamente al DNA e inibisca la trascrizione dei geni che controllano la fase S; risulta chiaro che lo stato di fosforilazione di pRb rappresenta un elemento critico per la progressione del ciclo cellulare.
Il gene oncosoppressore p53, localizzato sul braccio corto (p) del cromosoma 17, è probabilmente il gene più alterato nelle neoplasie maligne dell’uomo; la proteina p53 è un fattore trascrizionale (fosfoproteina) che agisce principalmente al passaggio G1 -> S per regolare la crescita cellulare e l’apoptosi mediante l’attivazione dei geni come il p21/WAF1/CIP1 e Bax. L’arresto del ciclo cellulare avviene nella fase G1 tardiva ed è causato dalla trascrizione, mediata da p53 e dell’inibitore delle CDK p21 inibendo in questo modo la fosforilazione di pRb necessaria alla progressione della cellula nella fase S. P53 interviene direttamente in questo processo inducendo la trascrizione di GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage), una proteina coinvolta nei processi di riparazione del DNA; se il danno viene riparato con successo, p53 attiva un gene chiamato mdm2, il cui prodotto si lega a sua volta a p53 e lo inattiva, sbloccando in questo modo il ciclo cellulare. Se invece il danno al DNA non può essere riparato in maniera soddisfacente, la p53 induce i geni dell’apoptosi: i geni bax e IGF-BP3 che stanno sotto il controllo di p53 e che eseguono l’ordine di morte che parte da esso.

Riassumendo, p53 è in grado di riconoscere il danno al DNA e di contribuire alla sua riparazione bloccando le cellule in G1 ed attivando geni specifici; una cellula che abbia subito un danno al DNA che non può essere riparata è indirizzata da p53 all’apoptosi. Tenendo conto di queste sue funzioni, nel caso in cui si abbia una perdita omozigote di p53, il danno al DNA non viene riparato e le mutazioni permangono nelle cellule che, continuando a dividersi, iniziano un percorso destinato alla trasformazione maligna. Il gene p16, localizzato sul cromosoma 9p21, codifica per una proteina che lega la chinasi-4-ciclina-dipendente (CDK4), prevenendo la sua interazione con la ciclina D e quindi la formazione del complesso CDK4/D1 interrompendo quindi una via vitale dell’inibizione della crescita cellulare. Il gene WT-1, localizzato sul cromosoma 11p13 è associato allo sviluppo del tumore di Willis; la proteina WT-1 è un regolatore della trascrizione che probabilmente inibisce la trascrizione di geni che promuovono la crescita cellulare. Gli altri meccanismi che regolano la proliferazione cellulare sono:

• Nelle cellule che sviluppano mutazioni di p16, ciclina D o CDK4, la funzione del gene Rb è altrata anche se il gene Rb non è di per sé mutato.
• La TGF-β inibisce la proliferazione cellulare e questo effetto è indotto, almeno in parte, dall’attivazione degli inibitori delle CDK p27 e p15; il TGF-β costituisce un’ampia famiglia di polipeptidi ad attività mitotica che determinano una vasta serie di fenomeni biologici come la stimolazione della crescita cellulare e della differenziazione, l’angiogenesi, l’invasione cellulare, la costituzione della mattrice extracellulare e la regolazione delle funzioni immunitarie. I TGF-β agiscono mediante legame con un recettore di superficie ad attività chinasica di tipo serina-treonina, che interagiscono con le SMAD costituendo dei complessi che, entrati nel nucleo, agiscono come attivatori della trascizione.
• Le proteine trasformanti di diversi virus oncogeni a DNA animali ed umani sembrano agire, in parte, neutralizzando l’attività di inibizione della crescita esercitata da pRb; pertanto la proteina pRb diviene funzionalmente deleta, essendo incapace di legare i fattori di trascrizione E2F, che a loro volta sono liberi di guidare la progressione della cellula nel ciclo cellulare.
• Altre alterazioni sono state riscontrate a carico del gene per la suscettibilità al carcinoma mammario chiamato BRCA2.

Il destino finale di tutti i segnali, siano essi positivi che negativi, è quello di arrivare al nucleo dove si decie se la cellula si deve dividere o no; in contrasto con l’oncogene ras che aumenta la sua funzione in seguito ad una mutazione attivante, i geni oncosopressori contribuiscono al processo di cancerizzazione mediante la loro inattivazione.

Il corpo di un animale opera in un ecosistema i cui singoli membri sono cellule, che si riproducono per divisione cellulare e sono organizzate in complessi collaborativi, ossia i tessuti; molte proteine coinvolte nella riparazione del DNA, nella segnalazione cellulare, nel ciclo cellulare, nella morte cellulare programmata e nell’architettura tissutale, sono state scoperte a causa di anomalie della loro funzione che portano alla proliferazione incontrollata, ad alterazioni genetiche e ad altre caratteristiche di comportamento “antisociale” delle cellule cancerose. Perché si verifichi una trasfromazione neoplastica, sono necessarie svariate alterazioni geniche quali l’aumentata espressione di oncogeni (i quali codificano per i fattori di crescita, recettori per fattori di crescita o per ormoni, trasduttori intracellulari di segnale proliferativo, fattori di trascrizione nucleare e proteine adibite al controllo del ciclo cellulare), inattivazione di geni oncosopressori e delezioni di frammenti di cromosomi. Mutazioni durante la mitosi cellulare si verificano continuamente, ma se i processi di correzione non vengono alterati la riparazione del danno cellulare avviene senza conseguenze e la cellula continua la sua crescita senza produrre neoplasie. È doveroso puntualizzare che uno dei maggiori fattori scatenanti le neoplasie è assolutamente la modaliità di vita dove inquinamento, cibi transgenici, conservanti chimici, pesticidi, fitofarmaci, ecc., che non sono in linea alla nostra omeostasi, danno severi colpi alle memorie biologiche e biochimche del nostra organismo e le alterazioni prodotte sono ascrivibili, appunto, alle neoplasie. Alla fine, tutte le linee delle cellule somatiche sono impegnate a morire: non lasciano progenie e dedicano invece la loro esistenza a supportare le cellule germinali, che sono le sole ad avere possibilità di sopravvivere; questo non è un mistero perché il corpo è un clone e il genoma delle cellule somatiche è lo stesso di quello delle cellule germinali che sono adibite a propagare copie dei propri geni. Perciò ciascuna cellula si comporta in maniera socialamente responsabile, restando a riposo, dividendosi, differenziandosi o morendo in base a ciò che è necessario per il bene dell’organismo; disturbi molcolari che alterano questa armonia significano problemi per l’intera società multicellulare. Una mutazione può dare a una cellula un vantaggio selettivo, permettendole di dividersi più rapidamente delle sue vicine e di diventare fondatore di un clone mutante in crescita; una mutazione che dà origine a questo comportamento “egoista” da parte di singoli membri della multicellularità può mettere in pericolo il futuro di tutta l’organizzazione cellulare. Questi sono gli “ingredienti-base” del cancro: malattia i cui singoli cloni mutanti di cellule iniziano a proliferare a spese dei loro vicini, ma alla fine distruggono l’intera società cellulare. Si può senza dubbio affermare che le cellule neoplastiche derivano da un’unica cellula mutata, che i cicli cellulari sono processi legati ad una serie di eventi biochimici in parte ben conosciuti: la correzione degli errori che portano alle neoplasie non può essere effettuata se non con una precisa e mirata tecnologia biologica che tenga conto dei cicli vitali delle cellule.

Gli eventi di una divisione di una cellula eucariotica. I processi di divisione nucleare (mitosi) e divisione cellulare (citogenesi), chiamati collettivamente fase M, occupano di norma soltanto una piccola frazione del ciclo cellulare; l’altra parte, molto più lunga, del ciclo è nota come interfase. Sono mostrati i cinques stadi della mitosi: un brusco cambiamneto dello stato biochimico della cellula avviene alla trascrizione da metafase ad anafase; una cellula si può fermare in metafase prima di questo punto di transizione, ma una volta che questo punto è stato sorpassato, la cellula va avanti fino alla fine della mitosi e attraverso la citochinesi e quindi fino all’interfase.

Nella maggior parte delle cellule ci sono diversi punti nel ciclo cellulare, chiamati punti di controllo, al cui livello il ciclo può essere arrestato se gli eventi precedenti non sono stati completatati (Vedi figura sotto riportata).

Punti di controllo e sistema di controllo del ciclo cellulare.
Informazioni sul completamento degli eventi del ciclo cellulare, oltre che segnali provenienti dall’ambiente, possono provocare l’arresto del ciclo da parte del sistema di controllo in corrispondenza di punti di controllo specifici.
I puntri di controllo più evidenti si trovano nelle posizioni marcate con ricuadri gialli.

L’ingresso in mitosi è impedito, per esempio, quando la replicazione del DNA non è completa e la separazione dei cromosomi in mitosi è ritardata se qualche cromosoma non è attaccato in modo appropriato al fuso mitotico. Al cuore del sistema di controllo del ciclo cellulare sta una famiglia di proteine, note come “kinasi dipendenti da ciclina” (CdK); l’attività di queste kinasi aumenta o diminuisce man mano che la cellula progredisce attraverso il ciclo; le oscillazioni portano direttamente a cambiamenti ciclici nella fosforilazione di proteine intracellulari che iniziano o regolano gli eventi principali del ciclo cellulare (la replicazione del DNA, la mitosi e la citocinesi). Un aumento dell’attività di CdK all’inizio della mitosi, per esempio, porta ad una aumentata fosforilazione di proteine che controllano la condensazione dei cromosomi, la demolizione dell’involucro nucleare e l’assemblaggio del fuso.
Ci sono quattro classi di cicline; tre di queste classi sono necessarie in tutte le cellule eucariotiche:

Ci sono circa 30 enzimi E2 strutturalmente simili ma distinti nei mammiferi e centinaia di proteine E3 diverse che formano complessi con specifici enzimi E2; ubiquitina ligasi distinte riconoscono segnali di degradazione diversi e perciò marcano per la degrdazione serie diverse di proteine intracellulare che portano questi segnali (Vedi figura).

Proteine denaturate o comunque ripiegate male, oltre a proteine che che contengono amminoacidi ossidati a o anormali, sono distrutte perché presentano sulle superfici sequenze amminoacidiche o motivi conformazionali che sono riconosciute come segnali di degradazione da una serie di molecole E3 nel sistema ubiquitina- proteosomi. La via proteolitica descritta è in grado di distinguere fra le proteine completate che hanno conformazioni sbagliate e i molti polipeptidi in crescita su ribosomi (oltre ai polipeptidi appena rilasciati dai ribosomi) che non hanno ancora raggiunto la loro conformazione ripiegata normale. Il livello finale di ciascuna proteina in una cellula eucariotica dipende dall’efficienza di ciascun passaggio illustrato nella figura sotto riportata.

Un dimero del dominio a dita di zinco della famiglia di recettori intracellulari attaccato alla sua sequenza specifica di DNA. Ciascun dominio a dita di zinco contiene due atomi di Zn (indicati dalle piccole sfere grigie): uno stabilizza l’elica di riconoscimento del DNA (mostrata in marrone in una subunità e in rosso nell’altra), e uno stabilizza un’ansa (mostrata in viola) coinvolta nella
formazione del dimero. Ciascun atomo di zinco è coordinato da quattro residui di cisteina spaziati in modo appropriato; come le proteine elica-giro-elica, le due eliche di riconoscimento del dimero sono tenute separate da una distanza che cosrrisponde ad un giro della doppia elica del DNA. L’esempio specifico rappresentato è un frammento del recettore dei glucocorticoidi, che è la proteina tramite la quale le cellule rilevano e rispondono trasacrizionalmente gli ormoni glucocorticoidi prodotti nella ghiamdola surrenale in risposta a uno stress.

Molte proteine che regolano i geni riconoscono il DNA come omeodimeri e di solito la proteina responsabile della dimerizzazione è distinta da quella che è responsabile dell’attacco al DNA; un motivo però combina queste due funzioni e si chiama motivo a cerniera lampo di leucina; vedi figura sotto riportata.

L’etrodimerizzazione è un esempio di controllo combinatorio, in cui coimbinazioni di proteine diverse, enon singole proteine, controllano un processo cellulare ed è uno dei maccanismi usati dalle cellule eucariotiche per controllare l’espressione dei geni e si verfica in una grande varietà diversa di geni di proteine che
regolano i geni. Vedi figura sotto riportata.

Un etero dimero composto da due proteine a omeodominio legate al suo sito di riconoscimento sul DNA. L’elica 4 gialla della proteina a destra (Matα2) non è stratturata in assenza della proteina a sinistra (Mata1) e forma un elica soltanto in seguito a eterodimerizzazione. La sequenza di DNA è così riconosciuta congiuntamente da entrambe le proteine; queste due proteine sono di un lievito gemmante, in cui l’eterodimero specifica un tipo cellulare particolare.

Un altro motivo importante che lega il DNA, correlata alla cerniera lampo di leucina, è il motivo elica-ansa-elica (HLH), esso consiste di una breve α elica connessa da un ansa ad una seconda α elica più lunga, come illustrato nella figura sotto riportata.

Il funzionamento degli interuttori genetici.

La maggior parte delle proteine regolatrici che attivano la trascrizione, cioè la maggior parte delle proteine che attivano i geni, ha una coinfigurazione molecolare che consiste di almeno due domini distinti: un dominio riconosce, di solito, una sequenza regolatrice specifica di DNA, un secondo dominio, chiamato talvolta, dominio di attivazione, accelera la velocità di inizio della trascrizione, come illustrato nella figura sotto riportata.

A): una proteina attivatrice legata in prossimità di un promotore attrae il complesso dell’oloenzima; secondo questo modello, l’oloenzima (che contiene più di 100 subunità proteiche) è portato al promotore separatamente dai fattori generali di trascrizione TFIID e TFIIA. Il DNA spezzato in questa enelle figure successive indica che questa porzione della molecola di DNA può essere molto lunga e di lunghezza variabile.
B): disegno schematico di un esperimento in vivo il cui risultato supporta il modello del reclutamento dell’oloenzima per le proteine attivatrici; il dominio che lega il DNA di una proteina è stato fuso direttamente ad un componente proteico del mediatore, un complesso proteico a 20 subunità che è parte del complesso dell’oloenzima, ma che è facilmente dissociabile dal resto dell’oloenzima.
Quando il sito di legame per la proteina è ibrido ed inserito sperimentalmente vicino ad un promotore, l’inizio della trascrizione è fortemente aumentato; in questo esperimento, il dominio di attivazione dell’attivatore è stato omesso, suggerendo che una frazione importante del dominio di attivazione sia semplicemente quella di interagire con il complesso della RNA polimerasi oloenzima e aiutarne così l’assemblaggio al promotore. La capacità delle proteine attivatrici di reclutare il macchinario di trascrizione sui promotori è stata dimostrata anche direttamente usando immunoprecipitazione della cromatina. Le proteine attivatrici legate al DNA aumentano di norma la velocità di trascrizione fino a 1.000 volte, il che è in accordo con una interazione relativamente debole e non specifica fra l’attivatore e l’oloenzima. Oltre alle loro azioni dirette sull’assemblaggio della RNA polimerasi oloenzima e dei fattori di trascrizione del DNA, le proteine che attivano i geni promuovono anche la trascrizione combinando la struttura della cromatina delle sequenze regolatrici e dei promotori del gene. Molte proteine attivatrici fanno uso di entrambi questi meccanismi legandosi a istone acetil transferasi (HAT), note comunemente come istone acetilasi, e a complessi di rimodellamento della cromatina dipendenti da ATP, reclutandoli perché funzionano sulla cromatina nelle vicinanze. Vedi figura sotto riportata.

Cinque modi in cui i repressori eucariotici possono operare.

A): proteine attivatrici e repressori competono per il legame alla stessa sequenza regolatrice di DNA.
B): entrambe le protene possono legarsi al DNA, ma il reprerssore si lega al dominio di attivazione della proteina attivatrice impedendole così di svolgere le sue funzioni di attivazione. In una variante di questa strategia il repressore si lega saldamente all’attivatore senza doversi legare direttamente al DNA. C): il repressore interagisce con lo stadio precoce del complesso che si sta assemblando dei fattori generali di trascrizione, bloccando l’ulteriore assemblaggio; alcuni repressori agiscono anche a stadi tardivi dell’inizio della trascrizione, per esempio, impedendo il rilascio della RNA polimerasi dai fattori generali di trascrizione.
D): il repressore recluta un complesso di rimodellamento della cromatina che riporto lo stato dei nucleosomi della regione del promotore alla sua forma pretrascrizionale; certi tipi di complessi di rimodellamento sembrano dedicati a ripristinare lo stato represso dei nucleosomi di un promotore mentre altri (per esempio, quelli reclutati da proteine attivatrici) rendono più accessibili il DNA compattato neo nucleosomi. Tuttavia lo stesso complesso di rimodellamento potrebbe in linea di principio essere usato sia per attivare che reprimere la trascrizione: a seconda della concentrazione di altre proteine nel nucleo, potrebbe essere stabilizzato lo stato rimodellato o quello represso. Secondo questa visione, il complesso di rimodellamento permette semplicemente alla struttura dela
cromatina di cambiare.
E): il repressore attrae un istone deacitilasi al promotore; una deacitilazione locale degli istoni riduce l’affinità di TFIID per il promotore e fa diminuire l’accessibilità al DNA della cromatina interessata.

Modello molecolare dell’evoluzione del carcinoma colo- rettale attraverso la sequenza adenocarcinoma.

Angiogenesi dei tumori

Oltre alla attività proliferativa delle cellule neoplastiche vi sono anche altri fattori che influenzano la crescita dei tumori e tra essi il più importante è costituito dall’apporto ematico. L’angiogenesi rappresenta l’elemento indispensabile non solo per la continua crescita tumorale, ma anche per la formazione delle metastasi, in quanto, senza accesso al sistema vascolare, le cellule tumorali non possono metastatizzare.

Studi recenti indicano che le cellule tumorali, nelle fasi iniziali della crescita, non presentano angiogenesi; i tumori rimangono semplicemente in situ senza sviluppare nessun supporto vascolare per mesi o anni, dopo di che, probabilmente a causa di un accumulo di mutazioni, alcune cellule contenute all’interno della neoplasia acquisiscono un fenotipo angiogenetico. Il gene p53 sembra inibire l’angiogenesi inducendo la sintesi della molecola antiangiogenetica trombospondiba-1; a seguita della inattivazione di p53 conseguente all’aquisizione di mutazioni su entrambi gli alleli, i livelli di trombospondina-1 crollano drasticamente, spostando il bilancio a favore dei fattori angiogenetici. L’invasività e la capacità di produrre metastasi costituiscono caratteristiche biologiche specifiche nei tumori maligni; per staccarsi dalla massa primitiva, entrare nei vasi sanguigni e linfatici e produrre una neoplasia secondaria che cresce a distanza, le cellule tumorali debbono attraversare la serie di fasi descritte nella figura sotto riportata.

La cascata metastatica: illustrazione schematica delle fasi della disseminazione ematogena di un tumore.

Invasione della matrice extracellulare

L’invasione della matrice extracellulare è un processo attivo che può essere schematizzato nei seguenti passaggi:Your Content Goes Here

Mentre l’effetto più ovvio della distruzione della matrice è la creazione di un passaggio che consenta alle cellule tumorali di invadere i tessuti circostanti, i prodotti che si formano dalla degradazione della matrice, derivati dal collagene e dai proteoglicani, hanno attività promovente la crescita, angiogenetica e chemiotattica.

Disseminazione vascolare e impianto delle cellule tumorali

In circolo le cellule tumorali tendono ad aggregarsi in gruppo; questo fenomeno è favorito dall’adesione omotipica tra le cellule tumorali e le cellule del sangue, in particolar modo le piastrine. La formazione di aggregati piastrine-cellule tumorali sembra aumentare la soppravvivenza e la possibilità di impianto delle cellule tumorali stesse. Questi trapianti di cellule neoplastiche possono essere riferiti a tre meccanismi così ripartiti:

• Dato che la prima fase del processo che porta le cellule tumorali ad uscire dai vasi è rappresentato dall’adesione all’endotelio, è possibile che le cellule tumorali presentino molecole di adesione i cui ligandi sono espressi preferenzialmente sulle cellule endoteliali di organi bersaglio.
• Alcuni organi bersaglio possono presentare sostanza chemiotattiche, quali ad esempio i fattori di crescita insulino-simili di tipo I e II, che tendono a reclutare le cellule tumorali.
• In alcuni casi il tessuto bersaglio può risultare inospitale per la crescita delle cellule tumorali metastatiche, ad esempio producendo in loco proteasi che inibiscono l’impianto di una colonia tumorale.

Chemioterapia delle malattie neoplastiche

Al momento, la chemioterapia adiuvante segue, di norma, il trattamento locale del cancro al seno, al colon e al retto e altre localizzazioni tumorali, ed è impiegata come parte di un approccio multimodale al trattamento iniziale di molti altri tumori, inclusi stadi avanzati di neoformazioni localizzate alla testa e al collo dell’utero, al polmone, tumori cervicali ed esofagei, sarcomi di tessuti molli e tumori solidi pediatrici. Nella figura sotto riportata è riportata rassegna dei farmaci chemioterapici.

Tossicità di Ciclofosfamide e Ifofosfamide

Entrambe causano tossicità agli elementi del midollo osseo e alla mucosa intestinale, provocano grave mielodepressione con caduta della conta granulocitica; sono molto tossici nelle cellule delle mucose in fase di divisione, causando ulcerazioni della mucosa della bocca e denudazione intestinale. Altre tossicità d’organo, meno comuni, possono essere irreversibili e anche letali; tutti i farmaci alchilanti inducono fibrosi polmonare e, con alti dosaggi, un danno endoteliale che può che può precipitare patologie veno-occlusive del fegato; le nitrosuree, dopo cicli mutipli di terapia, possono dar luogo ad insufficienza renale; l’Ifofosamide in patologia ad alto dosaggio causa frequentemente neurotossicità centrale con convulsioni, coma e, talvolta, morte. La tossicità sul sistema nervoso centrale si manifesta sotto forma di nausea e vomito; l’Ifosfamide è il più neurotossico fra questi farmaci, provoca stati mentali alterati, coma, convulsioni generalizzate e paralisi. Tutti gli alchilanti possono indurre leucemia e hanno effetti tossici sul sistema riproduttivo maschile e femminile causando spesso amenorrea permanente, in particolare nelle donne in perimenopausa, e azoospermia irreversibile nell’uomo.

Etoposide e Teniposide

Dalla podofillotossina, estratta dalla pianta della mandragora, sono stati sviluppati due glicosidi semisintetici del principio attivo che hanno dimostrato attività terapeutica significativa in molte neoplasie umane. Etiposide e Teniposide sono simili per attività e spettro d’azione, non arrestano il ciclo cellulare in mitosi ma formano un complesso ternario con la topoisomerasi II e il DNA; la formazione del complesso provoca la rottura della doppia catena di DNA, ma il passaggio a chiusura della catena, che normalmente fa seguito al legame della topoisomerasi al DNA, viene inibito dal farmaco. L’enzima rimane legato all’estremità libera del DNA tagliato, con conseguente accumulo di frammenti di DNA e morte cellulare; le cellule nelle fasi S e G2 del ciclo cellulare sono più sensibili all’Etoposide e alla Teniposide; (se questo è il meccanismo di azione sulle cellule neoplastiche sorge spontaneo domandarsi come possa il farmaco non agire sulle cellule sane). I farmaci vengono impiegati, in associazione con Ifofosfamide e Carboplatino, nel trattamento del carcinoma del polmone a piccole cellule, nella leucemia acuta dei bambini, nel glioblastoma, nel neuroblastoma e nelle metastasi cerebrali di carcinomi polmonari. Nella figura sotto riportata sono evidenziate le strutture chimiche dei farmaci.

Effetti tossici di Etoposide e Teniposide

I principali effetti tossici sono rappresentati da mielosopressione, nausea, vomito, leucopenia, stomatite, diarrea; sono state pure osservate febbre, flebiti, dermatiti e reazioni alergiche compresa anafilassi e la tossicità epatica si manifesta specialmente dopo somministrazione di dosi elevate.

Cisplatino

Il cis-diaminodicloroplatino è un complesso contenente platino divalente, inorganico e idrosolubile; il Cisplatino sembra entrare nelle cellule per diffusione e la sua formula di struttura è la seguente

I complessi del platino possono reagire con il DNA formando legami crociati intracatena e intercatena; l’azoto in posizione 7 della guanina è molto reattivo e il platino forma legami crociati tra guanine adiacenti sullo stesso filamento di DNA; si formano rapidamente anche legami crociati guanina-adenina. I complessi del DNA con Cisplatino inibiscono la replicazione e la trascrizione del DNA e portano a rotture e errori di codifica. La specificità del Cisplatino rispetto alle varie fasi del ciclo cellulare sembra essere diversa a seconda del tipo di cellula, sebbene gli effetti dovuti alla formazione dei legami crociati siano più marcati nella fase S. La chemioterapia combinata con Cisplatino, Bleomicina, Etoposide e Vinblastina, è utilizzata per il carcinoma del testicolo; nel carcinoma dell’ovaio è impiegato con Paclitaxel e Ciclofosfamide, viene inoltre utilizzato nel carcinoma della vescica, della testa e del collo dell’utero, nel carcinoma endometriale, nel carcinoma polmonare a cellule piccole e in alcune neoplasie dell’infanzia.

Effetti tossici

L’ototossicità non varia con la diuresi e si manifesta con tinnito e perdita dell’udito nell’intervallo delle alte frequenze e può essere più grave nei bambini; nausea e vomito compaiono in quasi tutti i pazienti; dopo cicli ripetuti compare neuropatia periferica, che può peggiorere dopo l’interruzione della terapia. Disturbi elettrici comprese ipomagnesemia, ipocalcemia, ipokaliemia e ipofosfatemia sono comuni; sono state osservate iperuricemia, convulsioni, anemia emolitica e anomalie cardiache, reazioni anafilattiche, caratterizzate da edema facciale, broncocostrizione, tachicardia e ipotensione, che possono presentarsi entro pochi minuti dalla somministrazione. Per gli effetti della formazione di legami crociati il Cisplatino è mutageno, teratogeno e cancerogeno.

Carboplatino

Il meccanismo di azione e lo spettro di attività clinica sono simili al Cisplatino, ma questo è meno reattivo del Cisplatino e non si lega alle proteine plasmatiche in modo significativo; la formula di struttura è sotto riportata.

Il Carboplatino viene impiegato, come alternativa al Cisplatino, in pazienti con insufficienza renale, nausea refrattaria, problemi uditivi gravi o neuropatia; la sua dose di impiego deve essere modificata in proporzione alla riduzione della clerance della creatina in pazienti con valori inferiori a 60 mg/ml.

Effetti tossici

Nausea, neurotossicità, ototossicità e nefrotossicità sono meno frequenti che con il Cisplatino; la principale tossicità dose-limitante è la mieolosoppressione, che si manifesta con trombocitopenia.

Modello di attivazione del gene ras. Quando una cellula normale è stimolata dalla attivazione di un recettore per un fattore di crescita, la forma inattiva ( legata al GDP) del ras viene attivata, passando ad uno stato a cui si lega al GTP. Il ras attivato recluta raf-1 e stimola la via della MAPchinasi, che trasmettono il segnale al nucleo. La proteina mutata rimane permanentemente in uno stato attivo in quanto non è in grado di idrolizzare il GTP; conseguentemente la cellula viene continuamente stimolata anche in assenza di segnali esterni. L’ancoraggio del ras alla membrana cellulare mediante la catena farnesilica è necessario per la sua azione.

Proteine regolatrici della trascrizione nucleare

Il destino finale di tutte le vie di trasduzione del segnale è quello di entrare nel nucleo e di regolare la trascrizione di un gran numero di geni che controllano la normale progressione della cellula attraverso le diverse fasi del ciclo cellulare; questo processo è regolato da una famiglia di geni i cui prodotti si localizzano alivello del nucleo, dove a loro volta controllano la trascrizione dei geni che ragolano la proliferazione. Un intero gruppo di oncoproteine, fra cui i prodotti degli oncogeni myc, myb, june e fos si localizzano nel nucleo; tra questi il gene myc è quello più comunemente coinvolto nella genesi dei tumori umani. Gli effettivi meccanismi di controllo della proteina c-myc sulla replicazione cellulare non sono ancora completamente chiariti; è stato però dimostrato che, sia prima che dopo il trasporto nel nucleo, la proteina c-myc forma un eterodimero con un’altra proteina chiamata max e l’eterodimero myc-max è un potente attivatore trascrizionale che si lega a specifiche sequenze di DNA. Un altro membro di questa super famiglia di regolatori trascrizionali, mad, può legarsi a max e formare un dimero; l’eterodimero mad-max agisce come repressore della trascrizione e sembra che il livello di attivazione trascrizionale di c-myc sia regolato non solo dai livelli dalla proteina c-myc ma anche dalla quantità e disponibilità delle proteine max e mad.
Mentre l’espressione c-myc è perfettamente regolata durante la normale proliferazione cellulare, le versioni trasformanti di myc sono associate ad una persistente espressione e, talvolta, ad una iperespressione della proteina myc; questo porta ad una aumentata trascrizione di geni critici e alla possibile trasformazione neoplastica. Una alterata regolazione di c-myc conseguente a traslocazione è quella che si verifica nel linfoma di Burkitt, un tumore delle cellule B; inoltre c-myc è implicato nei cacinomi della mammella, del colon, del polmone e in molti altri, mentre i geni N-myc e L-myc (correlati a c-myc) sono amplificati nei neuroblastomi e nel carcinoma del polmone a piccole cellule.

Regolatori del ciclo cellulare

Per comprendere le alterazioni del ciclo cellulare che portano al cancro è essenziale ricordare le normali funzioni di queste proteine ed i meccanismi che le regolano; le chinasi-ciclina dipendneti guidano il ciclo cellulare fosforilando specifiche proteine bersaglio che sono indipsensabili per la progressione della cellula nelle diverse fasi. Vedi figura sotto riportata.

Schema che illustra il ruolo delle cicline e delle chinasi ciclina-dipendenti (CDK) nella regolazione del ciclo cellulare. Nell’esempio riportata, la CDK viene espressa costitutivamente in una forma inattiva e viene attivata solo dopo essersi legata alla ciclia D, sintetrizzata nella fase G1; la forma attivata della CDK consente alla cellula di attraversare il punto di controllo che si interpone tra la fase G1 e la fase S mediante la fosforilazione della proteina del retinoblastoma (pRb). Appena la cellula entra nella fase S, la ciclina D viene degradata, riportando la CDK in uno stato inattivo.

Queste chinasi sono espresse costitutivamente durante tutto il cuclo cellulare in una forma inattiva e vengono attivate mediante fosforilazione dopo essersi legate ad un’altra famiglia di proteine chiamate cicline; a differenza delle CDK le cicline vengono sintetizzate durante specifiche fasi del ciclo cellulare e la loro funzione è quella di attivare le CDK.
Sebbene ogni fase del ciclo cellulare venga attentamente controllata, il passaggio dalla fase G1 alla fase S rappresenta un punto di controllo estremamente importante, in quanto, una volta che una cellula ha oltrepassato questa barriera, è autorizzata a procedere verso la fase S. Quando una cellula riceve segnali che ne promuovono la crescita, durante la fase G1 precoce si ha la sintesi delle cicline di tipo D, che si legano alla CDK4 e CDK6; in una fase più avanzata dela G1 si ha poi la sintesi della ciclina E che a sua volta si lega alla CDK2; vedi figura sotto riportata.

Attivazione degli oncogeni

Si distinguono due tipi di modificazioni:

1. modificazioni della struttura del gene che provocano la sintesi di un prodotto genico anomalo (oncoprpteina) con funzione aberrante.
2. modifcazioni della regolazione dell’espressione genica che provocano una aumentata o inadeguata produzione della proteina, strutturalmente normale, che stimola la crescita cellulare.

Mutazioni puntiformi

Mutazioni puntiformi dei codoni 12, 13 e 61 dei geni N-ras, H-ras e K-ras causano sostituzioni amminoacidiche nelle proteine ras; le stesse così mutate attivano costitutivamente la trasduzione del segnale mediata da queste molecole. Mutazioni dei geni ras sono un evento molto diffuso in svariatissimi tumori umani: nei tumori solidi, possono considerarsi praticamente ubiquitarie, mentre nell’ambito delle neoplasie ematologiche esse sono ristrette alle leucemie linfoidi e mieloide acuta e al mieloma multiplo. Nella figura sotto riportata è espressa la rappresentazione schematica dei principali meccanismi di lesione genetica dei proto-oncogeni e dei geni oncosopressori.

Al centro della figura è esemplificato un gene normale, costituito dalla sequenza codificante (cioè gli esoni, rappresentata dal rettangolo bianco) e da sequenze regolatorie (SR), in posizioe 5’ rispetto alla sequenza codificante. Nel caso dell’amplificazione, il gene intero viene moltiplicato in un alto numero di coppie, spesso 50-100 nei tumori umani. Nel caso delle mutazioni puntiformi, un singolo nucleotide della sequenza codificante (indicato in figura con una M) viene sotituito da un altro nucleotide e questa sostituzione nucleotidica conporta una sostituzione aminoacidica a livello della proteina codificata dal gene. Nel caso della delezione, un tratto di genoma di dimensioni variabili viene perso dal corredo cromosomico della cellula; in figura la delezione è limitata alla sequenza codificante del gene. Nel caso della traslocazione, due geni, in condizioni normali
situati su cromosomi diversi, vengono giustapposti; nel caso in figura, i due geni implicati nella traslocazione e derivati da cromosomi diversi sono rappresentati da due rettangoli di diverso colore (uno bianco ed uno grigio). Le traslocazioni dei tumori umani comportono due effetti principali: in un primo caso, la traslocazione può sostituire le normali sequenze regolatorie del gene con quelle del gene cui viene giustapposto; nel secondo caso, i due geni coinvolti nella traslocazione possono forndersi in un unico gene ibrido, che darà luogo ad un trascritto di fusione.

Sebbene le mutazioni del ras siano molto comuni, la loro presenza non è essenziale per il processo di cancerogenesi; il processo di cancerogenesi può avvenire attraverso diverse vie e, tra esse, quelle della mutazione del ras e certamente una delle più seguite.

Riarrangiamenti cromosomici

Le due forme di riarrangiamento cromosomico che possono attivare proto-oncogeni sono così ripartite:

1. nei tumori linfatici, traslocazioni specifiche producono la iperespressione di proto-oncogeni mettendoli sotto il controllo degli elementi regolatori dei loci delle immunoglobuline e del recettore del linfocita T.
2. in molti tumori emopoietici le trasclocazione fanno si che sequenze normalmente non legate tra loro e localizztae su cromosomi diversi si ricombinino e formino geni ibridi che codifcano per le poteine chimeriche capaci di promuovere la crescita cellulare.

Il miglior esempio di iperespressione di un proto-oncogene indotta da una traslocazione è rappresentato dal linfoma di Burkitt; tutti questi linfomi sono caratterizzati dalla presenza di almenao una di tre possibili traslocazioni, tutte interessanti il cromosoma 8q24 (dove è stato mappato il gene myc) ed uno dei tre cromosomi in cui sono localizzati i geni delle immunoglobuline. Nel linfoma di Burkitt la forma più comune di traslocazione è quella in cui un segmento del cromosoma 8 contenente c-myc viene trasfrito sul cromosoma 14, banda 32; questa traslocazione porta c-myc vicino al gene che codifica per la catena pesante delle immunoglobuline (IGH). I meccanismi molecolari di attivazione di c-myc in seguito alla traslocazione sono variabili, in tutti i casi, comunque, le sequenze codificanti del gene rimangono intatte ed il gen c-myc viene espresso costitutivamente ad alti livelli. Il cromosoma Philadelphia, caratteristico della leucemia mieloide, cronica e di un gruppo di leucemie linfoblastiche acute, rappresenta un classico esempio di un concogene che deriva dalla fusione di due geni originariamente separati. In questo caso, infatti, una traslocazione reciproca fra cromosomi 9 e 22 porta alla porzione troncata del proto-oncogene c-abl (che origina dal cromosoma 9) vicino al locus bcr sul cromosoma 22; il gene ibrido c-abl-bcr codifica per una proteina chimerica che ha attività tirosin-chinasica; vedi figure sotto riportate.

Traslocazioni cromosomiche e oncogeni coinvolti nel linfoma di Burkitt e nella leucemia mieloide cronica.

Geni oncosopressori

La funzione fisiologica di questi geni è quella di regolare la crescita cellulare e la perdita di questi geni è un evento chiave in molti, se non in tutti, i tumori umani; i geni oncosopressori più significativi che controllano il ciclo cellulare e la trascrizione nucleare e che regolano pertanto la divisione cellulare.

Il gene Rb

La proteina Rb prodotta dal gene Rb è una fosfoproteina nucleare che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del ciclo cellulare; nel suo stato attivo p-Rb costituisce un freno al passaggio dalla fase G1 alla fese S del ciclo cellulare. Quando le cellule sono stimolate a dividersi, la proteina Rb viene inattivata mediante fosforilazione (pRb-P), il freno è rimosso e la cellula può passare il punto di controllo interposto fra la fase G1 e la fase S; una volta entrata in fase S, la cellula è in grado di completare il ciclo mitotico anche in assenza di ulteriori fattori di crescita. Le cellule quiescenti (nella fase G0 o G1 precoce) presentano la forma attiva, cioè ipofosforilata di pRb; in questo stato, pRb inibisce la regolazione cellulare legando e quindi sequestrando, i fattori di trascrizione che appartengono alla famiglia E2F. Quando le cellule quiescenti vengono stimolate da fattori di crescita, la concentrazione di cicline D ed E si innalza e la conseguente attivazione dei complessi ciclina D/CDK4, D/CDK6 e E/CDK2 portano alla fosforilazione di pRb; la forma ipoerfosforilata di pRb rilascia i fattori di trascrizione E2F, i quali formano degli eterodimeri con la famiglia di proteine DP ed attivano la trascrizione di diversi geni bersaglio. I dati più recenti sulla biochimica di queste attività suggeriscono che il complesso pRb-E2F si leghi attivamente al DNA e inibisca la trascrizione dei geni che controllano la fase S; risulta chiaro che lo stato di fosforilazione di pRb rappresenta un elemento critico per la progressione del ciclo cellulare. Se la proteina Rb è assente (causa una delezione del gene che la codifica) o se la sua capacità di regolare i fattori di trascrizione della famiglia E2F è alterata da mutazioni, i freni che agiscono sul ciclo cellulare vengono rilasciati e la cellula progredisce verso la fase S. Le osservazioni che emergono da quanto descritto sono: la perdita del controllo della normale proliferazione cellulare è un evento centrale del processo di trasformazione maligna e che almeno uno dei quattro elementi regolatori del ciclo cellulare (p16, ciclina D, CDK4, Rb) risulta mutato nella grande maggioranza delle neoplasie maligne umane. Vedi figura sotto riportata.

Ruolo di pRb nella regolazione della trascrizione G1 → S del ciclo cellulare. La forma ipofosforilata di pRb complessata ai fattori di trascrizione E2F si lega la DNA ed inibisce la trascrizione dei genei i cui prodotti sono necessari alla fase S del ciclo cellulare. Quando pRb viene forsforilata dai complessi ciclina D/CDK4, D/CDK6 e E/CDK2, rilascia i fattori E2F che attivano la trascrizione dei geni che regolano la fase S. La fosforilazione della di pRb è inibita dagli inibitori della CDK in quanto essi inattivano i complessi ciclina/CDK. Virtualmente tutte le cellule neoplastiche presentano una deregolazione del punto di controllo interposto tra la fase G1 e la fase S dovuta alle mutazioni di uno dei 4 geni che regolano la fosforilazione di pRb; questi geni (Rb, CDK4, ciclina D e p16) sono indicati da un asterisco.

Il gene p53

Le azioni relative alla proteine E2F richiede, par la sua ttività, la funzione del gene p53; questi è localizzato sul cromosoma 17 (banda p13.1), e rappresenta la seconda sede più frequente di alterazioini geniche nei tumori umani. La perdita omozigote del gene p53 si riscontra virtualmente in tutti i tipi di neoplasie, compresi i carcinomi del polmone, del colon, della mammella, che rappresentano i tre casi di morte più frequenti nelle neoplasie. La proteina p53 è localizzata nel nucleo, e quando entra in azione la sua funzione primaria è rappresentata dal controllo di trascrizione di diversi altri geni; probabilmente per l’azione proteolitica del sistema mediato dalla ubiquitina, la sua emivita è breve (20 minuti), pertanto a differenza di pRb, non sorveglia il ciclo cellulare. La proteina p53 entra in gioco come freno di emergenza quando il DNA è danneggiato da radiazioni ionizzanti, luce ultravioletta o sostanze chimiche mutagene; in risposta a questi attacchi al patrimonio genetico della cellula, il prodotto del gemne p53 si lega al DNA e stimola la trascrizione di alcuni geni che mediano due funzioni fondamentali: l’arresto del ciclo cellulare e la apoptosi. L’arresto del ciclo cellulare avviene nella fase G1 tardiva ed è causato dalla trascrizione, mediata da p53 e dell’inibitore delle CDK p21 inibendo in questo modo la fosforilazione di pRb necessaria alla progressione della cellula nella fase S. P53 interviene direttamente in questo processo inducendo la trascrizione di GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage), una proteina coinvolta nei processi di riparazione del DNA; se il danno viene riparato con successo, p53 attiva un gene chiamato mdm2, il cui prodotto si lega a sua volta a p53 e lo inattiva, sbloccando in questo modo il ciclo cellulare.
Se invece il danno al DNA non può essere riparato in maniera soddisfacente, la p53 induce i geni dell’apoptosi: i geni bax e IGF-BP3 che stanno sotto il controllo di p53 e che eseguono l’ordine di morte che parte da esso. Riassumendo, p53 è in grado di riconoscere il danno al DNA e di contribuire alla sua riparazione bloccando le cellule in G1 ed attivando geni specifici; una cellula che abbia subito un danno al DNA che non può essere riparata è indirizzata da p53 all’apoptosi. Tenendo conto di queste sue funzioni, nel caso in cui si abbia una perdita omozigote di p53, il danno al DNA non viene riparato e le mutazioni permangono nelle cellule che, continuando a dividersi, iniziano un percorso destinato alla trasformazione maligna. Vedi figura.

Geni che regolano l’apoptosi

Recentemente è stata identificata una grande famiglia che regolano l’apoptosi; il primo gene antipaptotico identificato, il bcl2, appartiene ad una grande famiglia di proteine che formano omodimeri ed eterodimeri, alcuni dei quali inibiscono l’apoptosi (come lo stesso bcl-2 e bcl-xS) mentre altri ( come bax, bad e bcl-xS) favoriscono la morte cellulare programmata. La base biochimica dell’azione di bcl-2, che portano all’attivazione di enzimi proteolitici (caspasi), responsabili della morte cellulare, non sono ancora ben note, ma sulla bse delle conoscenze attuali, questi meccanismi possono essere così riassunti:

• Il rilascio del citocromo C dai mitocondri che sembra rappresentare una fase critica della catena degli eventi che portano alla morte cellulare.
• Localizzati strategicamente sulla membrana mitocondriale esterna, bcl-2 ed i suoi partner si pensa regolino l’uscita del citocromo C dal mitocondrio verso il citoplasma.
• La risposta di una cellula agli stimoli apoptotici è determinata dal rapporto tra antagonisti (bcl-2, bcl-sL) ed agonisti (bax, bcl-xS, bad e bid) della morte cellulare; pertanto, sebbene gli omodimeri di bcl-2 favoriscano la soppravvivenza della cellula (probabilmente annullando bax che forma canali per l’uscita del citocromo C), gli omodimeri di bax favoriscono l’apoptosi. Vedi figura sotto riportata.

Regolazione della morte cellulare da parte di bcl-2, bax e p53. I dimeri di bcl-2 favoriscono lk’accumulo delle cellule inibendo l’apoptosi, mentre i dimeri di bax la favoriscono. La capacità del gene p53 di indurre l’apoptosi è mediata in parte dall’amentata sintesi della proteina bax.